优秀论文

Taqman锁核酸探针实时荧光定量PCR检测

乙型肝炎病毒DNA

王  清  伦立民  王丽华  宋广辉

（青岛大学医学院附属医院检验科）

乙型肝炎病毒(HBV)是病毒肝炎的重要病原体，发病范围扩展到全世界，特别是在亚洲，非洲、南欧和拉丁美洲。检测乙型肝炎在血清或血浆中的HBV DNA已成为诊断HBV感染和评价乙肝病人治疗疗效的一种标准实验室方法^[3-6]。另外，由于HBV基因变异，血清学检测并非是决定性的HBV传染的诊断方法，HBV DNA的检测在诊断那些不好确证的病例上特别有用^[7]。与其它商品化HBV DNA的测量方法比较，实时PCR是一种更高敏感性、更宽线性范围、测量更准确的方法^[10-14]。本文介绍一种新的Taqman LAN探针实时PCR并被对其方法学进行评估。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本

  巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型病毒阳性标本和人类基因组DNA作为阴性特异性对照标本由山东省分子病毒重点实验室提供。临床血浆标本来自青岛大学医学院附属医院患者. EDTA抗凝，分离血浆，置－20℃保存或立即检测。

1.1.2 引物与探针  PCR引物(P1、P2)为一对HBV X区基因特异引物，扩增该区片段长144bp，以上探针和引物由爱德检测有限公司提供。

1.1.3 试剂 UNG酶（尿嘧啶DNA糖基酶）、Hot-Taq DNA聚合酶、dNTP/dUTP、PUCm-T载体克隆试剂盒、质粒DNA提取纯化试剂盒由上海生工生物有限公司提供。比对用HBV-DNA real-time PCR kits由匹基生物工程股份有限公司生产，批号20100701，最低检测限5.0×10² IU/ mL。

1.1.4 仪器  紫外分光光度计(UV-1700(E)230CE，日本岛津公司)；凝胶电泳成像分析系统Gel Doc2000型(美国Bio-Rad公司)；恒温水浴箱：DK—S22型(上海精宏实验设备有限公司)； Stratagene荧光PCR扩增仪，振动培养箱，低温离心机等。
1.2 方法

1.2.1血浆HBV核酸提取  采用PEG沉淀提取法，方法为100μL血清标本与100μL提取液Ⅰ充分混合，13000r/min×10min离心，弃上清，沉淀物中加入25μL提取液Ⅱ打匀，煮沸10min，经13000r/min×10min离心后，取2μL上清液作为PCR扩增模板液。

1.2.2 制备标准品  DNA用高保真PCR扩增系统扩增PCR产物，经质粒DNA纯化试剂盒纯化后，与PUCm-T载体经T4 DNA连接酶连接,转化E.coli DH5α菌株，在含X-gal，IPTG，氨苄青霉素的LB平板上筛选白色转化子菌落，增菌后用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测A260/A280，比值在1.6-1.8之间的质粒可用。测定重组质粒PUCm-T-HBV提取物260 nm 吸光度,换算成质粒的拷贝浓度并-20℃保存备用。使用时用TE缓冲液10倍梯度稀释成4×10¹~4×10⁸IU/mL范围浓度的标准品。

1.2.3荧光实时定量PCR检测  引物P1、P2 0.3mM，探针：P3  0.2mM，Mg2+ 3.5mM，dATP、dCTP、dGTP、dUTP 200mM，TaqDNA聚合酶5U/100μL，UNG酶5U/100μL。置扩增仪中进行扩增。扩增条件为：37℃×5min , 95℃×1min应为3min;95℃×5sec, 60℃×15sec应为30sec, 循环次数为40，荧光信号收集设在60℃。反应体系设为40uL。

1.2.4 结果分析条件设定

阈值（threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线（无规则的噪音线）的最高点为准。

基线（baseline）应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域（所有样本荧光信号无较大波动），起始点（循环数）应避开荧光采集起始阶段的信号波动，终止点（循环数）应比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1-2个循环。与基线的交点的循环次数（Ct）值为纵坐标，HBV DNA浓度的对数值为横坐标，制作标准曲线，利用待测标本的Ct值求出相应的HBV DNA含量。

1.2.5质量控制  设置阴性对照（蒸馏水）、强阳性对照（10⁶IU /mL） 、临界阳性对照（10⁴IU/mL）。

1.2.6 荧光定量PCR的特异性、最低检测限和重复性试验  提取肝炎HBeAg(+)、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型病毒阳性标本和人类基因组DNA，用HBV-PCR系统进行检测，确定其特异性。

用于重复性评价的高、中、低浓度样品分别为A01,A02,A03,（HBV DNA virus load  10⁴IU /mL、10⁵ IU /mL、10⁷IU /mL)，分别测定两者的批内及批间重复性。每个样品每次平行测3-5次，每天检测1次，共检测3天。记录Ct值。

用TE缓冲液1:10倍连续稀释已知浓度的HBV DNA阳性标准品（4.0×10⁸IU/ mL），以此为模板，用HBV-PCR系统进行检测，40个循环内以能区别于阴性对照（蒸馏水），出现S形动态反应曲线的最低质粒浓度，确定为最低检测限，用以评价本方法的灵敏度。

用重组HBV质粒用TE缓冲液进行1:10稀释，以拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标，进行线性回归。根据标准曲线的线性，以维持相关系数在0.99以上来判断方法的线性范围。

1.2.7 试剂稳定性试验 将除Taq酶和UNG酶之外的所有荧光定量PCR试剂包括引物、荧光探针，MgCl₂，dATP、dCTP、dGTP、dUTP 混合反应液、标准品质粒每天冻融一次，做标准曲线，记录Ct值，比较前后Ct值计算间差异有无显著性。

1.2.8 临床比对试验 50例血清先经商品化试剂盒检测，其中有31例为阳性，19例为阴性。PG HBV-DNA real-time和本方法同时检测。

1.2.9数据分析  HBV  DNA载量取对数后，进行统计学分析，采用SPSS10.0 for Window 软件包处理获得的试验数据。以P<0.05差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 PUCm-T-HBV DNA重组质粒的构建

重组质粒PUCm-T-HBV经DNA测序证实为114bp，经DNASTAR 软件进行分析。结果显示该片段与HBV X基因有同源性。。

2.2 标准物质制备

  在优化的荧光定量PCR条件下，重组HBV质粒（4.0×10⁸IU/ mL）1:10倍连续稀释，得到7个标准品，做标准曲线，与基线的交点的循环次数（Ct）值为纵坐标，HBV DNA浓度的对数值，为横坐标，则Y=-3.425㏒（X）+45.72，相关系数为0.999。。

2.5 线性范围 

Fig.2结果显示，在4.0×10²～4.0×10⁸IU／mL之间,具有很好的相关性,回归方程为: Y=-3.425㏒（X）+45.72，相关系数为0.999。

2.3 敏感性(最低检测限)

 由Fig.3中可与看出，本方法与阴性对照（水对照）区别的最低模板浓度即检测灵敏度为400IU/mL。

2.4 特异性

 用HBeAg（＋）的血浆标本用本法均能检出阳性拷贝数，而巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型病毒阳性标本和30例献血者血浆的标本用本法检测均为阴性结果。

2.5 重复性

 结果见表1和2。该方法较好的批内（＜3.0%）、批间重复性（＜3.0%），低拷贝标本的变异系数(CV值)较小,而高拷贝标本则较大。

2.6 稳定性

  试剂反复冻融前后的标准曲线的Ct经配对t检验，t = 1.11，P>0.05，差异无显著性。冻融四次的线性方程的斜率和截距两两比较，差异无显著性。可以认为试剂稳定性较好，反复冻融对其检测性能影响较小。

2.7 与商品化HBV PCR试剂盒比对实验

将经过免疫学方法(酶联免疫)验证的31例已知的慢性乙型肝炎患者血清(其中大三阳标本16例，小三阳标本13例)、19例已知的正常血清分别用PG HBV DNA real-time PCR试剂盒和本方法进行HBV DNA荧光定量测定。19例正常血清用二种方法测定结果都为0(均低于最低检测限)，31例已知的慢性乙型肝炎患者血清测定结果见Tab. 5。31例患者血清二种试剂的检测结果相互之间差异小于一个数量级占80.6％（25/31） ，其中在同一数量级的占80.6％(25/31)，不在一个数量级但相差不到一个数量级的占19.4％ (6/31)，相差大于一个数量级的占0％(0/31)，两种试剂检测结果的算术平均数的差异都在一个数量级之内。两种方法相关性分析，相关系数为0.974（见Fig. 3）。 HBV DNA阳性标本用两种试剂检测均未出现假阴性结果。19例已知的阴性血清用此二种试剂检测所得结果均为0(检测结果低于试剂最低检测限)，也未出现假阳性检测结果。

2.8  患者HBV DNA载量检测

2.8.1外周血中HBV DNA定量检测与HBV标记物相关性 

    对331例青岛大学医学院附属医院就诊的住院或门诊乙型肝炎患者外周血中HBVDNA进行定量检测和乙型肝炎两对半指标进行定性检测。HBsAg(+)合并HBeAg(+)者及单纯的HBsAg(+)者，其HBV～DNA PCR阳性率最高，均大于95％。331例标本中共检测出PCR HBV—DNA阳性283例，阳性率为85．50％，在送检的标本中，大三阳(HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性)模式的标本其HBV—DNA PCR阳性率为98．52％，小三阳(HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性)检测模式中，HBV—DNA PCR阳性率为71．12％。

2.8.2 外周血HBV DNA定量检测在乙型肝炎治疗监测中应用

目前乙型肝炎患者外周血中HBV DNA定量检测主要用于乙型肝炎患者治疗（如贺普丁和干扰素等）的疗效观察及指导临床用药；从日常检测中选择了一例比较典型的病例进行了分析，病人为一例乙型肝炎急性期患者，经贺普丁治疗其外周血中HBV DNA含量显著性下降，4个月后HBV DNA含量降至8.0×10³拷贝／ml左右，改用干扰素治疗，6个月后检测不到HBV DNA病毒，此后相继出现HBcAb、HBeAb、HBsAb阴性,治疗效果极佳。

3 讨论

LNA技术(Locked Nucleic Acid)是一种近几年发展起来的核酸化学修饰技术（第三代反义寡聚核苷酸），即通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来^[17]。经过LNA修饰的DNA分子在PCR反应能增加反应的稳定性和靶标亲和性。据报道寡聚核苷酸中每引入一个LNA可以将熔解温度（melting temperature）提高9.6℃^[18]，强化后的杂交性能可以显著扩大实验检测的环境限制，可识别出单个碱基的错配，同时允许在单试管中进行更复杂的实验。本研究利用LNA技术设计TaqMan探针，建立了real-time PCR 检测乙肝病毒DNA载量的方法并进行了方法学评价。

在本文，我们提出了HBV HBV DNA的检测的LAN TaqMan实时PCR方法。通过方法学评价可以看出，本法具有很好的重复性、特异性和较高的灵敏度（400 IU/mL）和较宽的线性范围（400和10⁸ IU/mL）。使用重组HBV质粒作为实验标准品具有稳定性好，重复性好，扩增效率高等特点。

31例患者血清二种试剂的检测结果相互之间差异小于一个数量级占80.6％（25/31） ，其中在同一数量级的占80.6％(25/31)，不在一个数量级但相差不到一个数量级的占19.4％ (6/31)，相差大于一个数量级的占0％(0/31)，两种试剂检测结果的算术平均数的差异都在一个数量级之内。两种方法相关性分析，相关系数为0.974（见fig.3）。 HBV DNA阳性标本用两种试剂检测均未出现假阴性结果。19例已知的阴性血清用此二种试剂检测所得结果均为0(检测结果低于试剂最低检测限)，也未出现假阳性检测结果。按有关文献的标准^[20-24]，上述检测结果可以证明此两种试剂均具有较好的可比性。

（参考文献、图、表略）