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海绵共栖细菌中群体感应信号的GC-MS检测

郑  立¹  郭秀春^1,2  周文辉^1,2  陈军辉¹  杨佰娟¹  王小如^1,2

（¹国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心；²中国海洋大学化学化工学院）

本研究利用气质联用仪（GC-MS）建立了群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)的检测方法，并利用该方法分析了活性菌株粗提液中信号分子的产生及种类。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

7890N GC/5975N MS型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；Milli-Q（18.2MΩ）超纯水处理系统（美国Millipore公司）;N-酰基高丝氨酸内酯标准品（N-己酰基，N-辛酰基和N-十四酰基高丝氨酸内酯）购买于sigma公司，甲醇（色谱纯）。蛋白胨、酵母浸粉、磷酸高铁，以上药品购自世纪华晟国际科技有限公司。实验所用菌株是从南海海绵样品中分离得到的，并且经过活性检测后确定具有抗菌活性的18株海绵共栖细菌。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品制备

N-酰基高丝氨酸内酯标准品（C6-HSL、C8-HSL和C14-HSL）溶于甲醇配置成浓度为3 mg.mL^-1的母液，于-20 °C保存，母液稀释为300 μg.mL^-1用于GC-MS检测。

1.2.2 待测菌株粗提物的制备

将活化后的待测菌株接种于装有300 mL MB液体培养基的三角瓶中，25 °C在摇床上震荡（150 rpm）培养7天。培养液离心（8000 rpm.min^-1 ×10 min）除去菌体，用乙酸乙酯（100 mL×2）提取上清液，乙酸乙酯相37 °C蒸干，溶于1mL正己烷和二氯甲烷（2:1,v/v）的混合溶液中作为待测菌株的粗提取物。

1.2.3 GC-MS检测条件

气相条件：色谱柱为Agilent HP-5MS石英毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气为高纯氦气，流速为1 mL.min^-1；进样口温度200 °C，传输线温度为280 °C。升温程序为：初温150 °C，25 °C·min^-1升到280 °C，保持3 min。进样量：1 µL，分流进样（150：1），扫描方式为全扫描模式（scan）和选择离子检测（SIM）模式m/z 143。

质谱条件：电子能量70 eV，离子源温度230 °C，四极杆温度150 °C 。

2 结果与讨论

2.1 AHL标准品的GC-MS检测

利用全扫描模式，通过GC-MS对3种AHLs标准品进行了含量分析，色谱图如图2所示。从图2可以看出，C6-HSL，C8-HSL和C14-HSL标准混合液在9 min之内完全分离开，保留时间分别为3.741 min，4.548 min和7.218min。

图2中检测到的3个峰再通过质谱图进行鉴定。每种化合物的质谱图中都呈现出各自的分子离子峰，即C6-HSL（m/z 199），C8-HSL（m/z 227），C14-HSL（m/z 311）。并且我们从这3种高丝氨酸内酯的离子碎片图中发现，在m/z 143处均含有一个很强的离子峰。这与Cataldi所报道的色谱图相似^[14-15]。我们从图3中可以看出C6-HSL的主要电离碎片是m/z 143，其次还有一些特征的碎片，如m/z 156,125,83,71,57和43。在C8-HSL和C14-HSL的质谱图中也有这些特征碎片，并且均有m/z 143这个很强的离子峰。因此我们决定选择m/z 143作为标记碎片，利用选择离子扫描模式（SIM）用于待测菌株粗提液中AHLs的检测。

2.2 待测菌株粗提液中AHLs的GC-MS检测

我们选择SIM模式（m/z 143）用于18株具有抗菌活性的海绵共栖细菌代谢产物粗提液中AHLs的检测，通过将18株待测活性菌株的色谱图与AHLs标准液的色谱图进行比对，结果发现在大多数活性菌株提取液中都至少存在一种AHLs信号分子（C6-HSL、C8-HSL和C14-HSL）（表1），其中有两株菌株的代谢产物粗提液中均含有这3种AHLs信号分子，分别为菌株Pseudovibrio sp. Wcll-1-4-1和菌株Bacillus sp. SYMS-2-14-8（如图4所示）。

近年来，越来越多的学者利用不同的方法在许多微生物中检测到C6-HSL、C8-HSL及C14-HSL的存在^{[8,11-12,19-20]}，在许多海洋细菌，甚至在海绵共栖细菌中也发现了很多AHLs的存在^[21-22]。例如早在1997年shaw就利用TLC-生物传感器结合的方法从微生物P. fluorescens 2-79、Ralstonia solanacearum K60及Rhodobacter sphaeroides 2.4.1代谢产物中检测到C8-HSL的存在^[8]，随后Ravn利用4种细菌生物传感器菌株从148株Enterobacteriaceae中有64%可产生AHLs，并且在很多AHLs产生菌代谢产物中都发现了C6-HSL、C8-HSL及C14-HSL的存在^[20]。

众所周知，AHLs是革兰氏阴性菌（G^-）中介导群体感应的一类重要的信号分子。然而近年来有学者发现AHLs也可以作用于革兰氏阳性菌（G⁺）群体感应系统，并且在G⁺中还发现了酰基高丝氨酸内酯酶的存在^[23-24]。Qazi等发现AHLs可以拮抗Staphylococcus aureus中群体感应和毒性因子的表达^[23]。Dong等在芽孢杆菌(Bacillus)中检测到群体感应抑制剂酰基高丝氨酸内酯酶，他认为Bacillus可能是利用AHLs作为生长所需的营养物质^[24]。但是目前为止，还并未有在Bacillus中发现AHLs的报道。

在本研究中，我们利用GC-MS联用技术建立了快速有效检测群体感应信号分子AHLs的方法，通过检测发现18株活性菌株能够分泌AHLs，初步证实了海绵共栖细菌的抗菌活性与群体感应之间存在密切关系，并且本研究首次在Bacillus属细菌中检测到AHLs的存在。该研究为群体感应研究提供了一条新的思路，并为群体感应信号分子AHLs检测的方法学研究奠定了基础。

（图、表、参考文献略）