优秀论文

UPLC-MS/MS测定中药材中19种氨基甲酸酯农药残留量

张  燕  杨  钊  李欣荣  吴爱英

（青岛市药品检验所）

氨基甲酸农药是一类具有良好杀虫效果的广谱性农药,在中药材栽培中被广泛使用^[1]。氨基甲酸酯类农药对人体的急性毒作用与有机磷农药相似，抑制体内乙酰胆碱酯酶，使它失去分解乙酰胆碱的功能，造成组织内乙酰胆碱的蓄积而中毒。目前中药材中氨基甲酸酯类农药的主要测定方法有HPLC法、GC法、HPLC-MS法^[2]。HPLC法灵敏度低、选择性差。由于这类化合物大多数在高温条件下不稳定,采用GC法测定常发生严重吸附和分解。HPLC-MS法采用选择离子检测模式测定，选择性较差，易出现假阳性结果。本文建立的超高效液相-串联四极杆质谱联用检测中药材中19种氨基甲酸酯农药的方法，采用多反应监测模式（MRM），克服了已有方法的缺点，是一种选择性强、灵敏度高、准确、快速的检测方法。

1 仪器与试药

Acquity超高效液相色谱仪（UPLC），Quattro Premier XE 串联四极杆质谱仪，美国Waters公司。

对照品甲硫威(批号：SB05-109-2008)、速灭威(批号：GSB05-2303-2008)、甲萘威(批号：GSB05-2301-2008)、克百威(批号：GSB05-2300-2008)、残杀威(批号：GSB05-1863-2008)、灭多威(批号：GSB05-1857-2008)、三羟基克百威(批号：GSB05-1861-2008)、涕灭威砜(批号：GSB-1862-2008)、抗蚜威(批号：GSB-2304-2008)、涕灭威(批号：GSB05-1859-2008)和异丙威(批号：GSB05-2302-2008)均购自中国药品生物制品检定所。猛杀威 (批号：70104)、久效威砜(批号：80422)、二氧威(批号：61211)和丁酮威(批号：80118)均购自Dr.E。杀线威(批号：LB60135)和灭害威(批号：383-13A)购自Supelco。噁虫威(批号：6297X)购自Sigma。久效威亚砜(批号：5222X)购自Fluka。甲醇购自Merk公司；醋酸铵购自ACROS公司；分析用水为18.2 MW•cm^-1。100批中药材均购自菏泽市药材市场，经青岛市药品检验所中药室吴爱英主任鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件  色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈（2.1mm´100mm，1.7 mm）；柱温：35 ℃；流速：0.2 mL•min^-1；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液（1：1），0~9 min；乙腈25 %→67 %，9.1min；乙腈67 %→95%；10.6min，乙腈95 %→25 %。进样量：10 mL。

2.2 质谱条件  离子化模式：ESI⁺；检测方式：多反应检测（MRM）；毛细管电压：2.5 kV；萃取锥孔电压：4 V；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：550 L•h^-1；锥孔气流量：50 L•h^-1；氩气流量：0.18 mL•min^-1；

为提高检测的灵敏度，根据19种氨基甲酸酯类农药的保留时间，将其分成三个Function进行检测。Function1，检测时间0~3.5min，检测灭多威、灭害威、涕灭威砜、二氧威、久效威亚砜、三羟基克百威、抗蚜威、杀线威和久效威砜，共9种。Function2，检测时间3.0~7.0min，检测速灭威、叶蝉散、西维因、残杀威、涕灭威、丁酮威、呋喃丹和噁虫威，共8种。Function3，检测时间7.0~14.0min，检测猛杀威和甲硫威，共2种。

2.3 对照品溶液的制备  取对照品猛杀威、杀线威、丁酮威、二氧威、久效威砜、噁虫威、久效威亚砜、甲硫威、灭害威5.10，4.94，5.07，5.74，5.06，6.47，5.58，5.50，5.38mg，精密称定，分别置10个10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。对照品速灭威、甲萘威、克百威、残杀威、灭多威、三羟基克百威、涕灭威砜、抗蚜威、涕灭威、异丙威均为100mg/ml溶液，分别精密量取上述19种对照品储备液适量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得每1 L含7mg的混合对照品储备液并保存于冰箱中。

2.4 供试品溶液的制备  精密称取样品细粉10g，加入1g氯化钠，加80ml丙酮，冰浴超声30分钟（功率250W，频率25kHz），离心，上清液移入装有1g无水硫酸钠的锥形瓶中，放置30分钟。取50ml减压浓缩至近干，加入少量环己烷：乙酸乙酯（1:1）溶解样品并定量稀释至10ml，混匀，0.45mm滤膜过滤。取5ml滤液经凝胶渗透色谱（GPC）净化，以环己烷：乙酸乙酯（1:1）为流动相洗脱，收集洗脱液5ml。取2ml氮吹至近干，加入1ml甲醇：0.1%甲酸溶液（1:1）溶解样品。

2.5 标准曲线的制备  精密量取7 mg•L^-1混合对照品溶液适量，用甲醇-0.1%甲酸溶液（1：1）稀释至浓度依次为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg•L^-1的标准系列溶液，依法测定。19种对照品在1.0～100.0 mg•L^-1范围内线性良好。

2.6 检出限和定量限的测定  根据灭多威等19种对照品S/N=3时的溶液浓度，计算出检出浓度；根据S/N=10时的对照品溶液浓度，计算出定量浓度。

2.7 精密度试验  取50.0 mg•L^-1混合对照品液在拟定的UPLC-MS/MS条件下连续测定6次，灭多威、灭害威、涕灭威砜、二氧威、久效威亚砜、三羟基克百威、抗蚜威、杀线威、久效威砜、速灭威、叶蝉散、西维因、残杀威、涕灭威、丁酮威、呋喃丹、噁虫威、甲硫威、猛杀威定量离子峰面积的RSD（n=6）分别为1.1%，1.9%，2.1%，3.0%，1.7 %，1.4%，1.7%，3.0%，2.5 %, 1.9%, 0.9%, 0.8%, 0.5%, 2.0%, 0.9%, 2.0%, 0.9%, 1.4%, 1.5%。表明方法的精密度良好。

2.8 重复性试验  取75号样品（金银花，产地：河南），按“2.4”方法处理，平行6份，在上述UPLC-MS/MS条件下测定。灭多威、三羟基克百威、呋喃丹的平均残留量分别为4.0，51.0和7.7mg•L^-1，RSD（n=6）分别为3.0%，2.9%和2.5%，证明此方法重复性良好。

2.9 稳定性试验  取50.0 mg•L^-1混合对照品溶液分别在配制后0，2，4，6，12，18，24 h，用上述UPLC-MS/MS条件测定。根据灭多威、灭害威、涕灭威砜、久效威亚砜、三羟基克百威、抗蚜威、杀线威、久效威砜、速灭威、叶蝉散、西维因、残杀威、涕灭威、丁酮威、呋喃丹、噁虫威、甲硫威、猛杀威定量离子的峰面积计算RSD（n=7）分别为2.5%，2.8%，2.4%，2.0%，2.8%，1.9%，1.7%，2.4%，2.2%，2.9%，2.7%，2.8%，1.7%，1.8%，1.8%，2.0%, 2.4%,和1.6%，说明对照品溶液24h内稳定。试验中发现二氧威很不稳定。

2.10 回收率试验  精密量取混合对照品储备液适量，用甲醇-0.1%甲酸溶液（1：1）稀释，得1 mg•L^-1混合对照品溶液。精密称取不含19种氨基甲酸酯类农药的样品细粉10 g，共取九份，分别加入1g氯化钠，80 ml丙酮，每三份一组，分别精密加入0.04、0.4和0.8 mL混合对照品溶液按“2.4”处理，终浓度分别为5.0、50.0和100.0 mg•L^-1。在拟定的UPLC-MS/MS条件下测定并计算回收率。

3 讨论

3.1 试验中发现二氧威很不稳定，2个小时内含量下降4.7 %，随着时间的延长，含量基本以线性的速度下降，建议制备标准曲线时，临测定前加入该对照品。也可考虑不检测二氧威，因其不稳定在中药材中的残留时间短，所以危害相对也较小。

3.2 本实验建立的检测中药中19种氨基甲酸酯农药残留量的UPLC-MS/MS方法，采用MRM方式，选择性更强，灵敏度更高。

3.3 本文选用的19种氨基甲酸酯类农药基本涵盖了近年来常用的该类农药品种。在测定的100种中药材中，有十批样品含有一种氨基甲酸酯类农药，一批样品含有两种氨基甲酸酯类农药，一批样品含有三种氨基甲酸酯类农药。其中在五批样品中都含有残杀威、三批样品中都含有呋喃丹。

（参考文献、表略）