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光致电化学分析法测定葡萄糖氧化酶的催化活性

赵常志  俞  佳  赵改爽  焦  奎

（青岛科技大学化学与分子工程学院）

光致电化学分析方法是利用光能激发物质产生光电流，通过直接或间接检测光电流的强弱实现检测的目的。相对于光学方法而言，具有设备简单、成本低廉、易于微型化和集成化的优点。相对于电化学方法而言，由于光电流产生的原理类似于电催化原理，灵敏度高于一般电化学分析方法。

硫堇（Th）可与Fe^3+/2+在酸性介质中组成光电池，在酸性介质中O₂/H₂O₂的电极电位约为0.65 V，小于Fe³⁺/Fe²⁺的电极电位（0.77 V），氧化态的Th⁺在光照激发下，其基态能级E₀由–0.03 eV变至单重态能级E_0-0 2.03 eV，可以氧化H₂O₂，产生光致电化学效应。而激发态的Th⁺*被电子供体H₂O₂还原，继而其还原态Th在电极上又被氧化，再次参与光致电化学反应，从而不间断地产生光电流。本文将硫堇电聚合在光透电极的表面上，构建了光电化学界面，利用该界面同时具有光敏和电子受体的功能，与电子供体H₂O₂组成了一个新的光致电化学系统。在底物葡萄糖存在下，葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖生成电子供体H₂O₂，在不需要过氧化物酶的情况下可以简单、灵敏、快速地测定蛋白质的催化活性。

当PTh光电界面的偏压设定在0.40 V，电解质的pH值为5.5时，PTh光电界面对H₂O₂的光电流响应方程为i=20.1+212C，相关系数为0.9986，扣除空白后，可得Di/C_H2O2 = 211.9。当H₂O₂的浓度为1.0 μmol/mL时，令Di/C_H2O2为H₂O₂的光电流响应系数，即d = 212（nA/μmol/mL）。光电流在每隔50 s 连续10次光照后仅下降17.5 %，显示光电流响应有较好的稳定性。

诸多具有催化功能的蛋白质，如葡萄糖、胆碱、尿酸氧化酶等，在催化相应底物发生氧化反应时会释放出H₂O₂。根据这一性质，蛋白质催化活性被定义为：每分钟能转化1 µmol底物或生成1 µmol H₂O₂的酶耗量为1 U 。通过PTh光电界面对H₂O₂的光致电化学响应，不需要过氧化氢酶即可测定蛋白质的催化活性。GOD在50.0mmol/L葡萄糖存在的光电流随酶浓度的增加在一定范围内呈线性增大。所以在与PTh和H₂O₂反应的相同时间内，蛋白质催化活性Λ (U/mg)可表示为：

式中，Di为扣除空白后的光电流强度，V₀为底液体积（mL），V_i为样品体积（mL），δ为H₂O₂的光电流响应系数（nA/μmol/mL），2为H₂O₂与Th⁺*的反应系数，C为样品浓度（mg/mL），f为样品的稀释倍数. 表1是是对3种商品葡萄糖氧化酶催化活性的测定结果。

（参考文献、图、表略）