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胶束电动毛细管色谱法快速测定黄海葵中

来源:    发布时间:2011-2-22

胶束电动毛细管色谱法快速测定黄海葵中

多种核苷类化合物

陈军辉      赵恒强  程红艳  臧家业      王小如

(国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心)

1引言

核苷类化合物是人类生存活动的基本化学物质,其与不少代谢紊乱的疾病相关。如今,核苷及其碱基已在多种动植物种发现,如冬虫夏草[1,2]、贝母[3]等。但由于海洋药用生物机体复杂、含盐量,很少有方法能够快速的检测其中的核苷及其碱基(特别是多种核苷类化合物的同步检测)。本研究采用胶束电动毛细管色谱法,建立一种快速分离检测黄海葵体内15种核苷及其碱基的新方法。

2 实验部分

2.1 试剂和材料

甲醇(色谱纯)购于美国Tedia公司,丙酮和乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司,十二烷基硫酸钠(SDS)购于美国Sigma-Aldrich公司,其余试剂均为分析纯,实验用水为Milli-Q超纯水(18.2 MΩ)。15种核苷及其碱基标准品,5批黄海葵样品均来自青岛沿海。

2.2 仪器与设备

AgilentHP3D系统高效毛细管电泳仪,配DAD检测器(美国Agilent公司);64.5 cm×75 µm i.d. 未涂层扩展光程毛细管柱,有效长度为56 cm(美国Agilent公司);KQ-400KDE型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司)等。

2.3 样品处理

将所有样品于烘箱中60 烘干,置于干燥阴凉处保存。从贮藏的样品中抽取部分个体,切片、粉碎、过80目筛,混合均匀,制备成干粉,封装于样品瓶中备用。准确称取0.2 g样品置于比色管中,加入60%甲醇20 mL,室温条件下超声15 min,再重复提取2次。合并提取液后过滤,滤液于55旋蒸干,用2%氨水和4%甲醇的混合溶液10 mL复溶。复溶后的溶液6000 g离心10 min,上清液过0.45 µm微孔滤膜并脱气后,作为供试品溶液。

2.4 标准品和电解液的配制

配制0.1 mg mL-1虫草素10%的甲醇溶液,其余标准品配成0.1 mg mL-1 5%的氨水溶液,储备液于4 冷藏保存。将储备液用含2%氨水和4%甲醇的溶液稀释到0.025-80 mg L-1,用于标准曲线的制作。

25 mM磷酸氢二钠作为背景电解液(BGE),其中含有70 mM SDS。所有的电解液和标准品在使用前均过0.45 µm滤膜并脱气10 min

2.5 电泳条件

    运行缓冲液:25 mM磷酸氢二钠;分离电压:20 kV;实验温度:25 ;进样方式:压力进样50 mbar,进样3 sec;检测波长:260 nm。新毛细管柱在使用前用1 M氢氧化钠冲洗30 min,超纯水冲洗20 min,缓冲液冲洗10 min。每次实验间隔用0.1 M氢氧化钠冲洗2 min,超纯水和缓冲液各冲洗3 min

3 结果和讨论

3.1 MEKC分离条件的优化

3.1.1 SDS和缓冲液浓度的影响

    SDSMEKC中常用的一种表面活性剂。虽然由于其易产生气泡导致重现性下降,但可以通过超声脱气的方式加以解决。选用20-100 mMSDS加入到20 mM磷酸氢二钠缓冲液中观察其对核苷类化合物分离度的影响。结果显示,SDS浓度的不同对色谱峰的影响明显,随着其浓度的增大,峰的分离度增加,但峰形变差,出现拖尾现象,且分离时间延长。总体而言,含70 mM SDS缓冲液得到的色谱峰峰形优美、对称且分离度好。缓冲液浓度分别选15 mM20 mM25 mM30 mM35  mM40 mM进行对比,以25 mM作为缓冲液的浓度的结果较好。

3.1.2 pH值的影响

缓冲液的pH是化合物分离的一个重要参数,主要影响电渗流(EOF)和离子强度。根据文献[25],我们将pH选定在8.011.5之间观察其对化合物分离度的影响,用磷酸二氢钠和磷酸对pH进行调节。从结果来看,调节pH后的缓冲液分离度并无改善,甚至出现分离度下降的现象,所以无需调节缓冲液的pH,即可得到良好的分辨率和峰形。

3.1.3 有机改性剂的影响

    5%的甲醇、丙酮和乙腈作为有机改性剂来考察其对核苷类化合物分离度的影响。尽管甲醇有助于优化色谱峰的对称性,但对这15种化合物的分离度没有实质性的改善,因此实验中确定无需添加有机改性剂。

3.1.4 电压、温度和进样时间的影响

    实验的分离电压选在15-25 kV之间。随着电压的升高,化合物迁移时间减少,色谱峰的分辨率降低,选用20 kV为最佳的运行电压。温度对化合物的分离和运行时间也有影响,温度的升高同样会减少运行时间,以25 为最佳的实验温度。进样时间的不同对峰形的影响较大,进样时间增长峰形变差,色谱峰重叠。

    综上所述,实验的最终优化条件为:含有70  mM SDS25 mM磷酸氢二钠;分离电压20 kV;实验温度25 ;进样体积50 mbar3sec;检测波长260 nm。由此得到的15种核苷类化合物的混标以及黄海葵样品(No. 4)的色谱图。

3.2 方法学考察

3.2.1 标准曲线和检出线

     按毛细管电泳条件,通过混标的6个不同浓度,以峰面积为纵坐标,标准品浓度为横坐标,得到回归方程和线性范围并计算相关系数。检出限和定量限定义如下:检出线(LOD)为3倍信噪比,定量线(LQD)为10倍信噪比。15种核苷及其碱基的标准曲线、线性范围、LODLQD见表1,所有化合物的R2>0.9975LODLQD分别低于0.752.00µg mL-1

3.2.2 精密度

    按仪器条件,对同一标准品混合物重复进样6次,分别测得15个峰的相对保留峰面积,分别计算其相对标准偏差(RSD)。得到结果如下,相对保留峰面积RSD值在1.38%-7.61%之间。

3.3 样品测定

应用上述方法来评价5批黄海葵中核苷类化合物的含量。按文中2.2给出的方法制备样品,并通过线性回归方程来计算样品中核苷类化合物的含量(见表2)。其中肌苷的含量基本与冬虫夏草中的含量差不多[7]。而胸苷、鸟苷和黄嘌呤的含量也较高,均超过了1.00 mg g-1。所有核苷类化合物的总含量超过了11.6 mg g-1,其种类和含量都极其丰富,为黄海葵的进一步利用奠定基础。

(参考文献、图、表略)

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