优秀论文

UPLC-MS/MS测定康艾注射液中五种主要成分含量

杨  钊¹  张  燕¹  朱韵洁²  孙振平¹  李欣荣¹

（1青岛市药品检验所；2青岛大学医学院药学系）

康艾注射液主要成份为黄芪、人参和苦参素。有益气扶正，增强机体免疫功能。用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇女恶性肿瘤；各种原因引起的白细胞低下及减少症。慢性乙型肝炎的治疗。其药品标准中仅测定人参皂苷R_e、R_g1和苦参素的含量。其中人参皂苷R_e和R_g1采用高效液相色谱法测定，且分离效果不理想。文献报道中人参皂苷和黄芪甲苷的测定方法主要有高效液相色谱法、比色法、薄层色谱-分光光度法^[1,2]和HPLC-MS法^[3,4]。液相色谱与质谱的联用技术结合了色谱的高分离效能和质谱的高选择性、高灵敏度的特点，但文献报道的HPLC-MS法采用选择离子检测模式测定，选择性较差，易出现假阳性结果。近几年各种中药提取注射液的不良反应接连发生，所以作为高危品种的中药注射液的质量控制显得尤为重要。本文建立了同时测定黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、R_e、R_f、R_b1含量的超高效液相-串联四极杆质谱联用方法，采用多反应监测模式（MRM），克服了已有方法的缺点，为康艾注射液的质量控制提供了一种选择性强、灵敏度高、准确、快速的检测方法。

1 仪器与试药

Acquity超高效液相色谱仪（UPLC），Quattro Premier XE 串联四极杆质谱仪，美国Waters公司。

对照品黄芪甲苷 (批号：110781-200613)、人参皂苷R_g1 (批号：110703-200424)、人参皂苷R_e（批号：754-200115）和人参皂苷R_b1 (批号：110704-200420)均购自中国药品生物制品检定所。人参皂苷R_f (批号：RC201004010A)购自上海锐聪实验室设备有限公司。甲醇购自Merk公司；醋酸铵购自ACROS公司；分析用水为Millipore纯水。

2  方法与结果

2.1 色谱条件  色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈（2.1 mm´50 mm，1.7 mm）；柱温：30 ℃；流速：0.4 mL•min^-1；进样量：10 mL；流动相：乙腈-20mmol·L^-1醋酸铵，按表1梯度条件洗脱。

2.2 质谱条件  离子化模式：ESI⁺；检测方式：多反应检测（MRM）；毛细管电压：2.8 kV；萃取锥孔电压：4 V；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：550 L•h^-1；锥孔气流量：50 L•h^-1；氩气流量：0.26 mL•min^-1；取样锥孔电压及碰撞能量见表2：

为提高检测的灵敏度，根据五种标准品的保留时间，将其分成两个Function进行检测。Function1，检测时间0~8.0min，检测人参皂苷R_g1和人参皂苷R_e。Function2，检测时间8.0~15.0min，检测人参皂苷R_b1、人参皂苷R_f和黄芪甲苷。

2.3 对照品溶液的制备  取对照品黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、人参皂苷R_e、人参皂苷R_b1、人参皂苷R_f 11.30，11.03，9.83，14.70，12.40 mg，精密称定，分别置5个10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分别精密量取上述5种对照品储备液适量，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得200 mg•L^-1的混合对照品储备液并保存于冰箱中。

2.4 供试品溶液的制备  精密量取样品80 mL，加入甲醇-10mmol·L^-1醋酸铵（1:1）定容至10ml，混匀，0.2mm滤膜过滤。

2.5 标准曲线的制备  精密量取200 mg•L^-1混合对照品储备液溶液适量，用甲醇-10 mmol·L^-1醋酸铵（1:1）稀释至浓度依次为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000 mg•L^-1的标准系列溶液，依法测定。黄芪甲苷在5.0～500.0 mg•L^-1之间，人参皂苷R_e和R_g1在0.2～20.0 mg•L^-1之间，人参皂苷R_f和R_b1在10.0～1000.0 mg•L^-1之间线性良好。回归方程、相关系数等参数详见表3。其中500 mg•L^-1的混合对照品溶液的总离子流图见图1。

图1  混合对照品的总离子流图

2.6 检出限和定量限的测定  根据5种对照品S/N=3时的溶液浓度，计算出检出浓度；根据S/N=10时的对照品溶液浓度，计算出定量浓度。详见表3。

2.7 精密度试验  取200.0 mg•L^-1混合对照品液连续测定6次，人参皂苷R_f、人参皂苷R_b1和黄芪甲苷定量离子峰面积的RSD（n=6）分别为2.9%，2.7%和1.9%。取1000.0 mg•L^-1混合对照品液连续测定6次，人参皂苷R_e、人参皂苷R_g1定量离子峰面积的RSD（n=6）分别为2.8%、1.0%。表明方法的精密度良好。

2.8 重复性试验  取11号样品，按“2.4”方法处理，平行6份，在上述UPLC-MS/MS条件下测定。黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、人参皂苷R_e、人参皂苷R_b1和人参皂苷R_f的含量分别为48.1，85.0，49.1，7.93和25.9 mg•L^-1，RSD（n=6）分别为3.5%，3.4%，3.4%，3.1%和2.9%，证明此方法重复性良好。11号样品的总离子流图见图2。

图2  11号样品总离子流图

2.9 稳定性试验  取500.0 mg•L^-1混合对照品溶液分别在配制后0，2，4，6，12，18，24 h，依法测定。根据黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、人参皂苷R_e、人参皂苷R_b1和人参皂苷R_f定量离子的峰面积计算RSD（n=7）分别为2.1%，3.6%，3.7%，3.4%和2.9%，说明对照品溶液24 h内稳定。

2.10 回收率试验  分别精密量取对照品储备液黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、人参皂苷R_e、人参皂苷R_b1和人参皂苷R_f 150、250、200、20、80 mL于10 ml容量瓶中，用甲醇-10 mmol·L^-1醋酸铵（1:1）稀释至10 ml。精密量取11号样品4 0mL，共取六份，分别加入上述混合对照品溶液100 ml，用甲醇-10 mmol·L^-1醋酸铵（1:1）稀释至10 ml。依法测定并计算回收率，结果见表4。

2.11样品测定 14批样品分别按2.4处理，依法测定。黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、人参皂苷R_e、人参皂苷R_b1和人参皂苷R_f含量分别在42.59～56.50，57.58～118.33，24.87～75.06，3.44～12.56，20.69～34.06 mg•L^-1。

3 讨论

3.1康艾注射中的主要成分是人参、黄芪和苦参素，苦参素为添加的纯品。本文建立了同时测定黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、R_e、R_f、R_b1含量的超高效液相-串联四极杆质谱联用方法，操作简单、快速，一次测定就能较全面的反映康艾注射液配方中两种药材的质量。

3.2本文建立了同时测定黄芪甲苷、人参皂苷R_g1、R_e、R_f、R_b1含量的超高效液相-串联四极杆质谱联用方法，采用MRM方式，选择性更强，灵敏度更高，可以相对减少液相分离部分的工作量，特别适合于成份复杂的中药注射剂的质量控制。

（参考文献略）