优秀论文

 

HPLC-MS/MS测定罗非鱼中的四种四环素类药物残留量

刘艳萍¹  冷凯良¹  王清印¹  王志杰¹  王瑜^1，2.

（¹中国水产科学研究院黄海水产研究所；²上海水产大学生命学院）

本文建立了液相色谱-电喷雾串联质谱法检测水产品中TCs残留的方法，使定量和确证性分析一次性完成。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

Thermo Finnigan TSQ Quantum Access液相色谱-高分辨串联四极杆质谱联用仪，配有ESI源。

四环素、土霉素、金霉素和强力霉素标准品（纯度≥99.5%）；甲醇、甲酸、醋酸铵、乙酸乙酯（均为色谱纯）。

1.2 分析条件

色谱条件  色谱柱：MGⅡC18(2.1 mm × 150 mm，2.1 μm)；流动相：A，0.2％甲酸溶液(含0.5 mmol/L醋酸铵)；B，乙腈；流动相比例：A:B=7:3。流速0.25 mL/min。进样量：10 μL；柱温：室温。

质谱条件  离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式；喷雾电压：4100 v；鞘气压力：35psi；辅助气流量：3 L/min；离子传输管温度：350℃；源内碰撞诱导解离电压：10 v；锥孔电压：35 v；扫描模式：选择反应监测（SRM），选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表1；Q1半峰宽：0.7 Da；Q3半峰宽：0.7 Da；碰撞气压力：氩气，1.5 mTorr。

1.3 样品前处理

1.3.1 制样

取水产品可食部分，切成不大于0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm的小块，充分匀浆，备用。

1.3.2 提取

准确称取2.0 g样品置于50 mL具塞离心管中，加入MCI缓冲溶液8 mL，于旋涡振荡器上涡旋提取1 min，超声波提取10 min，以10000 r/min离心10 min，取上清液于50 mL梨形瓶中。重复上述提取步骤一次，合并提取液。

1.3.3 过柱

Oasis HLB柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，取上述上清液过柱，以1滴／秒的速度过固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5 mL 5%甲醇溶液淋洗，弃去全部流出液。减压抽干5 min，最后5 mL甲醇∶乙酸乙酯=10∶90（V /V )洗脱，洗脱液用氮气吹干(温度不超过50 ℃)。准确加入1.0 mL流动相，涡旋振荡溶解残留物，过0.2 µm滤膜到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。

1.3.4 标准曲线

分别准确移取0.1 μg /mL混合标准使用溶液0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL和1.0μg /mL混合标准使用溶液0.05 mL、0.10 mL于6个进样瓶中，用空白样品提取溶液配制2μg /L、5μg /L、10μg /L、20μg /L、50μg /L和100μg /L的标准溶液, 测定。

2 结果与讨论

2.1 提取净化条件的研究

2.1.1 萃取方式的选择

本研究比较了C₁₈柱、PEP柱和HLB 柱的净化效果，结果发现采用C₁₈柱净化,强力霉素没有保留,金霉素保留较少;采用PEP柱峰形分叉严重;采用HLB 固相萃取柱峰形好,回收率也比较高，且较稳定。

2.1.3 提取液的选择

本研究选用含有EDTA的弱酸性溶剂0.1 mol/L的Mcllvaine - EDTA缓冲液作为提取溶剂。分别调节缓冲液pH值为3.0、4.0和5.0，进行添加回收率试验，从表2中可以看出，pH为3.0和5.0的回收率偏低，pH为3.0的回收率低可能是因为Mcllvaine - EDTA缓冲液在pH为3.0时有结晶现象。pH为4.0的缓冲液的提取效果最佳。

2.2 色谱条件的优化

因此本实验选择的高纯硅胶基制备并经端基封闭处理的MGⅡC18柱，可满足检测的要求。对于流动相中的有机相，一般采用甲醇和乙腈，由于采用电喷雾模式，而电离机理中一个重要的过程为去溶剂化，乙腈比甲醇更易气化，故选择乙腈为流动相中的有机相。在流动相的水相中加入挥发性电介质醋酸铵、甲酸，可以使离子预先形成，提高离子化效率，在保持较好分离度的前提下获得理想的色谱峰。对于甲酸的最适浓度，分别比较了0.1%、0.2%和0.3%的甲酸溶液的影响，结果发现甲酸浓度为0.1%时，在相同浓度下TC没有响应值；0.2%的甲酸溶液可以更好地提高检测的灵敏度和分离效果；甲酸浓度为0.3%时，CTC没有响应值。

2.3 质谱条件的优化

TCs是两性物质，用针泵以20 μL/min的流速注入2 μg/mL的OTC、CTC、TC和DOC混合标准溶液，电离时会同时产生正负离子，但是实验表明，正离子[M +H]⁺采集到的信号较强，因此以正离子方式(EsI+ )进行采集。确定OTC、CTC、TC和DOC的分子离子分别为m/z 461、479、445和445。分别其作为母离子，进行子离子扫描，选取丰度最强的作为各自的定量离子。最后以选择反应监测(SRM)正离子模式优化锥孔电压（Skimmer offset）、碰撞能量（Collision energy）等质谱参数。

2.4 回收率和精密度试验

选取罗非鱼样品，添加4种TCs类标准品，添加水平为5.0μg/kg、10.0μg/kg和20.0μg/kg，考察方法的回收率。每个样品重复测定6次，考察方法的精密度。

3 结论

本试验将组织样品用MTC缓冲液提取水产品中的四环素类残留物, ，再经Oasis HLB固相萃取柱净化，采用电喷雾离子源，以正离子检测方式进行质谱分析，方法简单、快速,具有良好的精确度和回收率。

（参考文献及图、表略）