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基于多壁碳纳米管修饰电极的以桑色素钴（Ⅱ）为指示剂的DNA电化学传感器的研究

牛淑妍 吴明亮

（青岛科技大学化学与分子工程学院）

合成了桑色素钴(II)配合物Co(C₁₅H₉O₇)₂·3H₂O(简写为CoL₂)，通过元素分析和红外光谱对其进行了表征。运用电化学分析法研究了CoL₂与鲑鱼精DNA的相互作用。结果表明CoL₂通过嵌插作用与DNA结合，实验求得CoL₂与DNA反应的化学计量系数m = 2，化学平衡常数K_a = 3.59 × 10⁹ L²·mol^-2。用带有羧基的多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH）修饰玻碳电极，以电活性的CoL₂作为杂交指示剂，制备了一种新颖、灵敏的DNA电化学传感器。该传感器检测互补的ssDNA的线性范围为7.47 × 10⁻¹⁰ ~ 5.00 × 10⁻⁸ mol·L^-1，线性回归方程为ΔI_pa = {0.6694 ([S₂] / nM)} μA-0.3645 μA，相关系数r = 0.9989，检出限为8.2 × 10⁻¹¹ mol·L^-1（S/N = 3）。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI 832B电化学分析仪；多壁碳纳米管；鲑鱼精DNA；大肠杆菌病毒基因片断序列。

1.2 CoL₂金属配合物的制备（按照文献合成）

1.3 CoL₂与DNA相互作用的电化学研究

以0.2 mo1·L^-1的PBS (pH 6.0)缓冲液为底液，作桑色素钴的循环伏安曲线（CV）和微分脉冲伏安曲线（DPV）。CV扫描范围从 -0.2 V到0.7 V，扫速为0.20 V?s^-1。DPV仪器条件：起始电位-0.1 V，终止电位0.6 V，脉冲幅度0.05 V，脉冲宽度0.06 s，取样间隔0.002 V。

1.4 以CoL₂为指示剂的DNA电化学传感器的制备

化学修饰电极制备：带有羧基的多壁碳纳米管是在硝酸溶液中回流大约5 h制备的。移取5 μL 2.0 mg·mL^-1的MWCNTs-COOH悬浮液滴于倒置的玻碳电极表面，红外灯下烘干。

DNA探针固定：将多壁碳纳米管修饰的电极先后浸入含有10 mmol·L^-1 EDC的pH 5.2的醋酸盐缓冲溶液中1 h，和含有2.5 μmol·L^-1 探针DNA(S₁)的醋酸盐缓冲溶液中温育12 h。

DNA杂交：将修饰后的玻碳电极浸入含有一定浓度互补S₂或非互补(S₃)的0.20 mo1·L^-1，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液中，于37℃下搅拌反应1 h。然后将电极在室温下干燥。

1.5 电化学测定

将杂交好的玻碳电极嵌插指示剂后，于0.20 mo1·L^-1的PBS缓冲液(pH 6.0)中，扫描DPV曲线。DPV仪器条件：起始电位-0.1V，终止电位0.6 V，脉冲幅度0.05 V，取样间隔0.002 V。

2结果与讨论

2.1 CoL₂与DNA相互作用的电化学研究

在-0.1 V～+0.7 V的范围内，CoL₂有一对氧化还原峰，峰电位分别是E_pc 0.238 V，E_pa 0.310 V。其中，ΔE = E_pa-E_pc = 72mV，I_pa / I_pc > 1，根据CoL₂的结构，推断为配合物CoL₂中配体桑色素的电活性基团羰基在玻碳电极上发生了不可逆的电化学氧化还原反应。加入DNA后氧化峰电流明显减小，峰电位略有正移，表明CoL₂和DNA发生了嵌插相互作用。

2.2 pH对CoL₂氧化峰电流变化ΔI_pa的影响

研究了不同pH值下的CoL₂的CV曲线。随着pH值的增大，CoL₂的氧化还原峰电位均发生负移。pH值从4.5到8变化时，氧化峰电位E_pa与pH值呈线性关系，线性方程为E_pa = 0.6273 V – (0.05646 pH) V。根据文献^[3], E_pa = E⁰ – (0.059 m/n) pH, 其中m为参加电极反应的质子数，n为电极反应转移的电子数。说明在反应中有相同的质子数和电子数参加了反应。根据不可逆体系峰电位E_p与电子转移系数α 和电极反应转移电子数n的关系式：E_p – E_p/2 = 48 / (αn)， 可得到αn ≈ 2，令α = 0.5，则n = 4, 可以得出在该电极反应中，有4个H离子参加了电极的氧化还原反应。

2.3 扫速对CoL₂氧化峰电流I_pa的影响

考察了扫速对氧化峰电流的影响。结果表明CoL₂的氧化峰电流随着扫速的增加而增大。当扫速在0.15 V?s^-1到0.40 V?s^-1范围内，I_pa与ν^1/2成线性关系，回归方程是I_pa = {6.9254 [ν /(V/s)]^1/2 }μA - 0.2507 μA，相关系数r = 0.9954，表明CoL₂在玻碳电极上的电化学反应是由扩散控制的。

2.4 CoL₂与DNA相互作用的化学计量系数m和结合常数K_a

假设CoL₂与dsDNA只形成一种单一的复合物dsDNA·(CoL₂)_m。公式推导如下：

    dsDNA + mCoL₂ = dsDNA·(CoL₂)_m                                    (1)

K_a = [dsDNA·(CoL₂)_m ] /{ [CoL₂]^m·[dsDNA] }

可推出：log [ΔI_pa / (ΔI_{pa, max} − ΔI_pa)] = logK_a + mlog{[CoL₂] / M}                 (2)

本实验中，log [ΔI_pa / (ΔI_{pa, max} − ΔI_pa)]与log{[CoL₂] / M}呈线性关系，线性方程为log {ΔI _pa / (ΔI _{pa, max} − ΔI _pa )} = 9.555 + 2.1235 log {[CoL₂] / M}，线性相关系数 r = 0.9887。说明DNA与CoL₂生成唯一产物，因此根据直线的斜率和截距，可得出化学计量系数m = 2.1235（m ≈ 2），结合常数K_a = 3.59 × 10⁹ L²·mol^-2。

2.5 以CoL₂为指示剂的DNA电化学传感器的制备

据CoL₂与DNA的相互作用研究可知，CoL₂能够嵌插进入DNA分子的双螺旋结构中，因此CoL₂可以作为DNA杂交嵌插指示剂构建DNA电化学传感器。

2.6 玻碳修饰电极的表征

与裸玻碳电极相比，MWCNTs-COOH/GCE的背景电流明显增大，这说明MWCNTs-COOH修饰电极后明显增大电极的有效面积，电子传递的效率进一步加快。当核苷探针与MWCNTs-COOH/GCE结合后，羧酸峰电流明显下降，说明核苷酸上的氨基与修饰电极上的羧基通过肽键相结合，从而使ssDNA探针成功固定到了电极表面。

2.7 DNA电化学传感器的选择性

本实验选用较为灵敏的微分脉冲伏安法考察DNA修饰玻碳电极的选择性。ssDNA修饰玻碳电极的微分脉冲伏安曲线几乎没有电流响应，表明因静电作用吸附到电极表面的配合物可以忽略。而杂交了互补单链DNA的修饰电极在嵌合CoL₂一定时间后出现了与裸玻碳电极在CoL₂溶液中电位一致的氧化峰。然而，非互补ssDNA修饰玻碳电极在Tris-HCl缓冲溶液中几乎没有电流响应。说明以CoL₂作为嵌插指示剂的电化学DNA传感器可以有效地选择性识别目标DNA，非互补链DNA。

2.8 DNA电化学传感器检测的线性范围与检出限

改变靶ssDNA的浓度进行杂交，嵌合指示剂后扫描DPV曲线。在选定的最佳条件下，对不同浓度的靶ssDNA进行三次平行测定， 靶ssDNA浓度在7.47 × 10⁻¹⁰ ~ 5.00 × 10⁻⁸ mol·L^-1范围内，ΔI_pa与ssDNA浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为ΔI_pa = {0.6694([S₂] / nM)} μA-0.3645 μA 线性相关系数r = 0.9989，检出限为8.2 × 10⁻¹¹ mol·L^-1（S/N = 3）。

（参考文献及图、表略）

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