优秀论文

 

高效液相色谱-荧光检测法测定海带及浒苔中

吲哚乙酸的含量

冷凯良¹ 王瑜^1，2 王清印^1*  孙伟红¹  王志杰¹ 谭志军¹ 郭萌萌¹. 邢丽红¹ 刘艳萍^1，2

（¹中国水产科学研究院黄海水产研究所；²上海海洋大学水产与生命学院）

吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid）是一种调节植物生长发育的内源生长素，广泛分布于从藻类到被子植物的各类植物中，在植物的根、茎、叶、果实等各个器官中均有发现。吲哚乙酸作为一种重要的植物激素，是各类海藻肥产品的重要有效成分。目前，国内的海藻植物激素研究尚属于起步阶段，因此，完善海带中吲哚乙酸含量的测定方法，将为合理利用海带、浒苔资源，开发海带、浒苔海藻肥产品打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

    试验研究海带样本取自山东荣成寻山水产养殖场； 浒苔样本取自青岛市区沿海5处。

1.2 仪器和设备

Waters2695型高效液相色谱仪，2475型荧光检测器等。

1.3 试剂与溶液（略）

1.4 色谱条件

C18 Column色谱柱，4.6mm×250mm(id)，5μm，柱温为30℃；激发波长223nm，发射波长340 nm；流动相为甲醇：0.8%乙酸溶液=4：6，流动相用0.45微孔有机相滤膜过滤并超声脱气；流速1.0ml/min；进样量10µl。

1.5 吲哚乙酸提取过程

准确称取20g样品（精确至小数点后2位），加入5倍体积90%甲醇，4℃提取过夜。4000rpm离心5分钟，转移上清液入150ml鸡心瓶中，沉淀加20ml甲醇涡旋震荡，4000rpm离心5分钟，合并上清液。35℃减压浓缩至大约2ml。浓缩液调pH至3，过MAX固相萃取小柱。小柱用2ml甲醇和2ml水活化，加样后用2ml 5%氨水和2ml甲醇淋洗，最后用2ml酸化甲醇洗脱，收集洗脱液，35℃减压蒸干。2ml甲醇定容，过0.4μm的有机相滤膜，供液相色谱分析。

1.6 绘制标准曲线

将吲哚乙酸标准储备液配制成浓度为5、10、20、50、100 ng/ml的系列工作液。将绘制标准曲线用工作液从低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪，按其所得峰面积的平均值与对应的标准溶液浓度作标准曲线图，并计算回归方程及相关系数。

2 结果与讨论

2.1  标准曲线及回归方程 

以待测物质量浓度为纵坐标，以时间为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线，结果表明，吲哚乙酸的线性相关系数（R²）为0.999971。

2.2 回收率及灵敏度

    向20g海带样品中添加1.0μg /ml的吲哚乙酸标准溶液40μl 、100μl、200μl,最终定容至2ml，得回收率为70.79%-107.16%。

2.3 检出限及定量限

    向鲜海带中添加吲哚乙酸标准品（添加水平为4μg/kg·FW）,测得信噪比大于3，表明检测限可以达到4μg/kg·FW；向鲜海带中添加吲哚乙酸标准品（添加水平为10μg/kg·FW），测得信噪比大于10，表明定量下限可以达到10μg/kg·FW。

2.4 色谱条件优化

2.4.1荧光波长选择

    对浓度为10μg /ml的吲哚乙酸标准品进行荧光全扫描,扫描波长为EX:200nm-500nm;EM:200nm-500nm。发现，激发波长（EX）223nm，发射波长（EM）340 nm时具有最大荧光吸收值。

2.4.2 流动相选择

    选用乙腈、甲醇分别作为流动相进行比较（与0.8%乙酸的比例均为1：1，流速为1.0ml/min），发现乙腈做流动相保留时间较短，目标峰较宽，峰型较差。故选用甲醇做有机流动相。

    由于吲哚乙酸分子带有羧基，所以流动相需要维持酸性环境以保证吲哚乙酸为分子状态。本试验比较了0.8%甲酸、0.02mol/L草酸、0.8%乙酸三种实验室常用酸性流动相的效果，发现无论是保留时间还是峰型，三种流动相的效果均相似，故选择常用且较廉价的乙酸作为流动相。

2.4.3 流动相比例选择

甲醇与0.8%乙酸比例为4：6时，目标峰峰型较好，与杂质峰分离，干扰较少。

2.5前处理过程优化  

2.5.1 脱色、萃取

    向海带浸提液中加入1.0μg /ml的吲哚乙酸标准溶液100μl，减压蒸发至水相，调pH至8，等体积石油醚提取粗提液（水相）中的脂溶性色素3次，吲哚乙酸保留在水相中，蒸干，定容，液相色谱分析；石油醚去除色素后，水相调pH至3，用等体积乙酸乙酯或者无水乙醚萃取3遍，使吲哚乙酸分配至有机相中，蒸干乙酸乙酯，定容，液相色谱分析。

2.5.2 净化

由于海带中IAA的含量较少，初步去除色素后，杂质干扰仍然较多，故本实验选用了两种常用的固相萃取小柱：Cleanert ODS C18预处理小柱和Waters MAX固相萃取小柱进行净化。

2.6 吲哚乙酸检测结果（略）

3 结论

   青岛沿海浒苔中吲哚乙酸的含量在4.08—5.82μg/Kg·FW之间，由于浒苔含水较多，所以相对来说，具有较高的吲哚乙酸水平。

   浒苔经过不同的保存方式处理后，吲哚乙酸的含量均有所下降，其中阳光下晒干对于吲哚乙酸的破坏最严重，可能是晾晒过程中浒苔细胞内源性酶类释放，导致了吲哚乙酸的降解。淡水洗涤也会对吲哚乙酸的含量造成很大影响，由于淡水的渗透压低于浒苔细胞液，洗涤过程导致细胞破裂，细胞液流出，吲哚乙酸原本主要存在于植物的细胞液中，随着细胞液的流失，吲哚乙酸的含量也会大大的降低。因此，干净海水漂洗浒苔，低温（35℃）烘干保存，对于浒苔中吲哚乙酸的破坏最少。

（参考文献、图、表略）