优秀论文

 

基于蛋白质直接电子转移的全胆固醇传感器

赵常志 万 莉 徐华筠 王钦

（青岛科技大学化学与分子工程学院）

1 引言

胆固醇是人体中最丰富的类固醇，包括游离胆固醇和胆固醇酯两种形式，合称为总胆固醇。血清中正常胆固醇浓度范围是120~260mg dL⁻¹ (3。1~6.7mmol L⁻¹)。测定血清胆固醇含量已成为临床诊断中一项重要的参考指标，研究高灵敏、高选择性的胆固醇传感器具有重要的学术意义和应用价值。

本文基于血红蛋白的直接电化学，以壳聚糖为包埋材料分别把胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶固定在玻碳电极上，成功制备了三酶修饰的全胆固醇传感器。壳聚糖具有天然高分子网状结构和良好的生物相容性，能有效的保持酶的生物活性而不泄漏，提高了测定的灵敏度、重现性和稳定性。 由于采用较低的测定电位，能很好地分析避免抗坏血酸、尿酸等还原性物质的影响。制备的全胆固醇传感器已成功地应用于对血清样品中胆固醇含量的测定。

2 实验部分

2.1  试剂与仪器（略）

2.2  酶电极的制备

（1）将玻碳电极依次用用金相砂纸，0.1μm和0.05μm A1₂O₃抛光至镜面，然后分别在1:1硝酸、无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗，干燥备用。

（2）4.0 mg血红蛋白,加入3％壳聚糖溶液100μL，搅拌溶解。用微量注射器移取4μL涂膜液滴涂在玻碳电极表面，将电极垂直放置，自然干燥得壳聚糖包埋血红蛋白修饰电极。

（3）20μL胆固醇氧化酶与10μL的壳聚糖溶液混和搅拌。用微量注射器移取5μL混和液滴涂在上述血红蛋白修饰的电极表面，自然干燥4h。

（4）10mg 胆固醇酯酶溶于100μL 2％的壳聚糖溶液中搅拌溶解。取10μL混和液滴涂在上述血红蛋白和胆固醇氧化酶修饰的电极表面，自然干燥2h。即制得三酶修饰电极。电极在4℃冰箱中保存备用。

2.3  实验过程

    取适量测试样品于电解池中，插入电极，控制酶反应时间1 min，在一定电位间记录循环伏安曲线，测量不同样品的伏安特征；或控制工作电极的极化电位，记录样品的计时安培曲线，测量不同样品的电流响应。

3 结果与讨论

3.1  酶电极的检测机理

该传感器的酶反应与电极反应的多步骤反应系统表明，酯化的胆固醇在ChE的作用下水解，生成游离胆固醇，游离胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下与氧发生氧化还原反应生成H₂O₂，H₂O₂被还原态的血红蛋白催化还原，最后氧化态的血红蛋白（Hb_ox）在电极上还原，产生还原电流。其还原峰电流的大小与溶液中的胆固醇含量成正比，从而可定量溶液中全胆固醇的含量。 Hb在整个体系中不仅作为H₂O₂的催化剂，而且还充当了电极反应与酶反应的氧化还原媒介体。

3.2  酶电极的电化学响应

在溶解氧存在下，没有可观察到电化学响应的壳聚糖修饰电极，Hb修饰电极(HE)的循环伏安曲线在–0.325 V有一个明显的阴极峰，而阳极峰仅留下一点痕迹，这是由于Hb催化还原氧的结果，与文献的结果相同。酶修饰电极(HCCE)的循环伏安曲线显示，阴极峰与HE的相同，而阳极在0.100V附近能观察到明显的电流增加。经除氧10min后，该电流值显著减少，说明该电流是由氧的吸附所引起。在缓冲溶液中加入H₂O₂后，从HCCE的电化学响应，可观察到还原峰的电流明显增加，这是由于Hb催化H₂O₂的结果，显示出典型的酶催化反应的特征。

3.3  酶的最佳固载量和pH的影响

酶用量的多少是影响传感器性能的重要因素。本文考察了电极表面壳聚糖负载不同的酶量对胆固醇生物传感器电流响应的影响。固定壳聚糖浓度和涂膜液的量，增加酶的用量，电极响应增强。但当酶的用量超过一定值后，电流响应基本不变，这主要是由于敏感膜上酶量过多时，固载作用弱的酶相对量增多，比较容易泄露。由此可得到酶的最佳用量。

此外酶电极的催化活性、测定的灵敏度与稳定性与溶液的pH、反应温度、测定电位等因素有关。由于在酶反应体系中存在三种酶，为了最大程度保持酶的反应速度和活性，必须确定测定的最适pH值。将HCCE放在同浓度的胆固醇标准溶液中，分别调节pH值为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，在–0.325V检测其响应电流的实验表明，缓冲液的pH值在6.5到8.5的范围内具有较高的响应值，显示在这个pH范围中酶的活力最高，稳定性最好，当pH值上升或下降时，响应变小。考虑到血液的pH值呈微碱性，所以选用pH值7.0的缓冲溶液。另外酶的催化活性受温度的影响较大，使用传感器需要考虑温度的影响。由于生物传感器一般在室温下使用，所以实验温度控制为25℃。

3.4  酶电极对胆固醇的响应

经上述条件优化得到的胆固醇传感器在优化实验条件下，对胆固醇和胆固醇酯有着灵敏快速的响应。向缓冲溶液中加入不同浓度胆固醇酯，HCCE的催化电流随着胆固醇酯浓度的增加而增大。在–0.325V下，在加入相同浓度胆固醇后，HCCE的催化电流60s后进入相对稳定状态，且催化电流随着胆固醇浓度的增加而增大。表明生物酶在壳聚糖包埋的天然网状结构和生物兼容性环境中，能有效地保持和发挥其生物活性。酶电极的动态响应显示电流与胆固醇浓度在10.0~110 mg dL⁻¹的范围内成线性关系，相关系数为0.9965，检测限为5.0 mg dL⁻¹（S/N=3）。

3.5  传感器的选择性、重现性和稳定性

由于胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶对反应具有较好的特异性，胆固醇氧化酶对底物的特异性是具有3B羟基胆固醇的整个支链以及不饱和的甾体。血清中具有类似结构的物质含量很少，可以忽略不计。而血液中最容易对电极产生干扰的是尿酸和抗坏血酸。它们的正常含量分别是4~7mg dL⁻¹和0.4~0.59mg dL⁻¹。配制该范围内的抗坏血酸和尿酸进行试验，它们分别可以引起2.3%和1.5%电流的改变，不干扰对胆固醇的定量检测。

本文还研究了所制备传感器的重现性和稳定性。对5.00 mg dL⁻¹胆固醇酯标准溶液进行5次平行测定的RSD小于3.5%。五根电极在同样的条件下，对5.00mg dL⁻¹胆固醇酯进行测定，RSD为6.2%。当HCCE电极放在4°C冰箱中储存一个星期后，其电流为初始测定电流的96%，三周后电流仍保留了85%。

3.6  传感器对人血清中全胆固醇的测定

用本法对6份人血清样品总胆固醇含量进行的测量结果。为了避免样品的变质，在测量前必须用包括1.0％的异丙醇和0.8％的TritonX-100的pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液对样品稀释5倍，在40ºC水浴中加热5 min，然后冷却至室温下进行测定，记录时间－电流曲线，计算血液样品中胆固醇含量，同时用标准加入法做回收率实验。结果显示RSD小于6.1％，回收率为95~105％。

（参考文献、图、表略）