高效液相色谱法同时测定食品中的9种抗氧化剂
来源： 发布时间：2009-6-22高效液相色谱法同时测定食品中的9种抗氧化剂
段小娟 蔡 发 牟志春 王曼霞
（山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心）
1 引 言
食品中含有许多天然活性物质如维生素、单宁和不饱和脂肪酸，极易发生氧化和分解反应而变质，影响了食品的风味、品质和营养价值，甚至产生对人体健康有害的物质。向其中加入抗氧化剂，可以有效防止食品变质，保证其质量，但添加过量，会损害人体健康。本文采用正己烷（乙腈饱和）溶解样品，用含L-抗坏血酸棕榈酸盐（AP）的乙腈（正己烷饱和）萃取，浓缩后进行分析，不仅使杂质减少，而且保护剂AP可以有效地降低抗氧化剂在萃取和浓缩过程中被氧化的程度，提高回收率，同时降低了检出限。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
HP1100高效液相色谱仪配置紫外检测器等。
含AP的饱和乙腈：在饱和乙腈中加入0.01%（w/v）AP。
标准贮备液的配制：分别称取9种抗氧化剂各50 mg于50 mL容量瓶中，Rutin用甲醇溶解并定容，其它8种抗氧化剂用乙腈溶解并定容，摇匀，成为1 mg/mL标准贮备液，放置于4 oC的冰箱中存放。
2.2 色谱条件
色谱柱：Eclipse XDB-C18柱（150×
2.3 样品处理
准确称取
2.4 标准曲线的绘制
配制9种混合抗氧化剂标准系列溶液0.1、0.2、0.5、1、5、10、50、100、500、1000 mg/L，在给定的色谱条件下，进行分析，进样量是20 µL，记录保留时间与峰面积，以不同浓度及相应峰面积绘制标准曲线并进行线性回归。
3 结果和讨论
3.1 前处理方法的选择
采用甲醇、乙醇和乙腈作为提取溶剂，3种溶剂的提取效果都不错。经过实验证明，甲醇和乙醇提取的杂质太多，特别是极性弱的杂质更多，对测定BHT有干扰，最终影响结果的准确性。采用乙腈提取抗氧化剂，不仅提取效果好，且杂质含量相对偏低，提取前先用正己烷溶解油脂降低溶液黏度，提取效果更好。
另外在提取时加入保护剂AP，AP对金属离子有螯合作用，能使促进氧化的微量金属离子钝化，从而降低抗氧化剂在提取和浓缩过程中被氧化的程度，提高回收率，同时降低了检出限。
3.2 测定波长的选择
对9种抗氧化剂进行全波长扫描，结果发现9种物质在270 ~ 360 nm波长范围内有较大吸收，综合考虑，选择280 nm为检测波长。
3.3 流动相组成的选择
开始我们依照文献选用甲醇－水－醋酸体系为流动相，结果发现让9种物质完全分离需要35分钟，后改用乙腈－水－醋酸体系为流动相，分析时间缩短，且峰形较好。
3.4 梯度洗脱条件
在9种组分中，BHA、4-HR和OG及EQ、QR和TBHQ保留特性很相似，Rutin和BHT的保留特性差别又很大，因而在常规的等度洗脱条件下，难以在较短的时间内使它们彼此完全分开。我们采用对不同的梯度条件进行试验找到了最佳条件，可在28 min内将这9组分完全分离，能满足同时准确测定要求。
3.5 流动相酸度对分离的影响
考虑到所测9种抗氧化剂都含有羟基，在溶液中呈弱酸性，需要在酸性条件下测定才能使其完全以分子形式存在。我们固定了上述流动相比例，分别向乙腈中加入1%、3%和5%(V/V)的乙酸，测定三种酸度条件下9种物质的保留值和峰面积，结果表明：PH值的变化对保留值和峰面积的影响不大，但对峰形影响较大，加入1%乙酸时峰有些拖尾，加入3%和5%的乙酸峰形都很好。同时考虑色谱柱对酸度的适应范围，故选择向乙腈中加入3%的乙酸。
3.6 标准曲线和检出限
将标准工作液注入HPLC进行测定，以组分的色谱峰面积为纵坐标，组分的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明，9种组分在0.5~1000 mg/L浓度范围内有很好的线性相关性，检出限为0.1 ~ 0.5 mg/kg。
3.7 方法的精密度和回收率试验
在选定的色谱条件下对大豆油进行添加回收实验，3个添加水平分别为：0.5、5和50 mg/kg。按照样品处理方法进行提取净化，测定9组分含量，计算回收率，其平均回收率（ ）和相对标准偏差（Sr）见表2（n = 7）。
（参考文献、图、表略）