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引物与探针设计

引物：分为正向和反向引物，通过对GC含量（50%-60%）的控制来避免引物二聚体形成以及 控制退火温度。一般会把此次病毒病预防控制所发布的两对引物，GC含量都在50%左右且退火温度均维持在50-60℃之间。

探针：使用探针以增加扩增子的特异性，减少假阳结果。探针序列必须有别于引物序列，且C含量多于G含量，过高的G含量会降低反应效率。探针的长度控制在18-30bp最佳，过长会导致淬灭效果不佳。图1展示的两个探针长度分别为28和20bp。

图1：病毒病预防控制所公布的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列

扩增子：即目的病毒核酸扩增片段，同理，选择含有特定GC量的片段来避免形成二级结构，长度在60-120bp。

我们在这里只是粗略地介绍了引探设计中需要考虑的因素，即便从理论出发所设计的引物与探针看似一切无虞，但在实际操作中仍会出现各式各样的问题，在后文我们会提及体系优化以达到最佳检测效果。

模板制备

首先需要明确模板类型，此次需要检验的2019-nCoV病毒便是单股正链RNA病毒。

现下的新冠肺炎是呼吸道疾病，且可由飞沫进行传播，咽部是病毒高度聚集的部位，因此样本采集途径是收集就诊者咽拭子标本或者是痰液；所有的样本模板制备过程中都进行纯化和质控管理。

体系优化

聚合酶在这个实际体系优化中作为最重要的关键原料，这对检测试剂盒的灵敏度，特异性，重复性，扩增效率等性能指标至关重要。

催化酶的优化在最初期，厂家会选择多家供应商的产品进行测试，目的是选择最适合该反应体系的催化酶。而原料供应商提供的聚合酶配套的buffer也往往非工业生产过程中的最优配方，需要不断调试离子浓度，pH值等以达到最佳反应体系。

探针浓度的优化主要依靠背景信号强度、探针与靶的结合效率、PCR扩增的效率、引物的浓度等进行优化。目的是既使背景荧光最小化，又没有降低实验的敏感性，从而得到最佳实验结果。

引物也需要浓度优化，并且在设计过程中，会准备多对引物与探针匹配，选择能够给出最低Ct值，到达但是却能给出最高反应终点荧光值的引物。（Ct值：即荧光量到达阈值所需的循环数）

对于引物退火温度，理论值与实际温度会有一定出入，通常使用梯度PCR来确定最佳效率的退火温度。

由于2019-nCoV与SARS CoV高度同源，因此还需制备阳性对照来避免假阳性的可能。

性能检测

当一切准备就绪后，就需要进行性能测试，而这也是最耗费时间的。

大致为：

灵敏度测试、重复性测试、稳定性测试、最低检测浓度、特异性及其他干扰物质的影响、精密度分析等。

为何现在试剂盒仍旧供不应求？首先，正值春节，工厂产能有限、物流人手有限；其次，2019-nCoV具有高传染性，因此对于检验实验室和检验人员都有一定要求，并非每一家医院都有配备负压条件的实验室。但是我们同时也非常欣喜地看到，截止目前，共有7家企业研发的新型冠状病毒检测试剂盒进入了国家药监局的快速审批通道，湖北省更是提出采取先试用后申报的办法，允许在医疗机构先试用，疫情解除后再按程序审核。

默克作为体外诊断试剂的原料供应商，感谢各位新型冠状病毒检测试剂盒生产企业同仁们的默默付出，争分夺秒赶制病毒检测试剂盒。默克也将持续为客户供应最优质的原材料，若各位有任何需求，请随时联系我们。如需大量供货，我们将通过默克在全球的57家工厂以及完备的供应链第一时间为你们保驾护航！相信大家齐心协力一定能打赢这场没有硝烟的战争！